衛生部辦公廳關于印發 突發中毒事件衛生應急處置15個技術方案的通知

              2013年3月18日

              各省、自治區、直轄市衛生廳局,新疆生產建設兵團衛生局,中國疾病預防控制中心:

                   為指導各地規范、有效地開展常見突發中毒事件衛生應急處置工作,我部組織制定了氨、氯氣、硫化氫、砷化氫、一氧化碳、單純窒息性氣體、苯及苯系物、甲醇、氰化物、亞硝酸鹽、鹽酸克侖特羅、有機磷酸酯類殺蟲劑、抗凝血類殺鼠劑、致痙攣性殺鼠劑14類常見毒物急性中毒事件衛生應急處置技術方案和《突發中毒事件衛生應急處置人員防護導則》?,F印發給你們(電子版可從衛生部網http://www.moh.gov.cn下載),請參照執行。

                  聯系人:衛生部衛生應急辦公室  韓玉紅

                  電話:010-68792714

                  附件:1.氨
              2.氯氣
              3.硫化氫
              4.砷化氫
              5.一氧化碳
              6.單純性窒息性氣體
              7.苯及苯系物
              8.甲醇
              9.氰化物
              10.亞硝酸鹽
              11.鹽酸克倫特羅
              12.有機磷酸酯類殺蟲劑
              13.抗凝血類殺鼠劑
              14.致痙攣性殺鼠劑
              15.化學中毒事件應急醫學人員防護導則
                                        
                                              二〇一一年七月六日

              急性抗凝血類殺鼠劑中毒事件
              衛生應急處置技術方案


              抗凝血類殺鼠劑主要包括香豆素類和茚滿二酮類兩大類,前者如溴敵隆、殺鼠靈、殺鼠醚、殺它仗等,后者有敵鼠、氯敵鼠、殺鼠酮等。急性抗凝血類殺鼠劑中毒是指短期內接觸抗凝血類殺鼠劑后引起的以凝血功能障礙為主的全身性疾病。
              1概述
              抗凝血類殺鼠劑多數為黃色/白色粉末或結晶,難溶于水,可溶于丙酮、乙醇、氯仿等有機溶劑,化學性質大多穩定??鼓悮⑹髣┐蠖酁楦叨净騽《净瘜W物(附件1)。
              抗凝血類殺鼠劑中毒途徑主要為經口攝入,絕大多數為食源性中毒,如食用抗凝血類殺鼠劑污染的食品和飲料,偶見于鼠藥的生產和分裝。
              2中毒事件的調查和處理
              2.1現場處置人員的個體防護
              現場調查人員進入殺鼠劑生產、儲存現場調查時,必須穿戴防顆粒物口罩、工作服、乳膠手套或化學防護手套。
              現場采樣人員采集食品樣品時,需要穿戴防顆粒物口罩、工作服、乳膠手套或化學防護手套。
              醫療救護人員在救護中毒病人時,一般不必穿戴防護裝備。
              2.2中毒事件的調查
              調查人員到達中毒現場后,應先了解中毒事件概況,然后進行中毒事件相關場所、人員等調查工作,并及時向中毒事件指揮部提出收集并封存所有可疑中毒食品、其他可能導致本次中毒事件物品的建議。
              2.2.1中毒事件相關場所的調查
              生活性中毒事件的調查對象包括中毒事件涉及的食品生產、加工
              1
              至食用整個過程的各個場所,調查內容包括食品加工過程(包括使用的原料和配料、調料、食品容器、使用的工具),食品的分裝、儲存的條件等。生產性中毒事件的調查對象主要為生產、儲存場所,調查內容包括生產工藝流程、環境狀況、通風措施、防護條件、人員接觸情況等。
              2.2.2中毒事件相關人員的調查
              調查對象應包括中毒病人、目擊證人以及其他相關人員(如飯店負責人、廚師、服務員、食品采購員、同工作場所工人等)。調查內容包括接觸時間、接觸物質、接觸人數、中毒人數、中毒的主要癥狀、中毒事件的進展情況、已經采取的緊急措施、飲食的加工方法、食品的來源等。同時,還應向臨床救治單位進一步了解相關資料(如搶救過程、臨床治療資料、實驗室檢查結果等)。
              2.2.3現場周圍環境和生活習慣的調查
              如某一地區反復出現此類事件,則調查內容還應包括現場周圍是否同時有動物大量死亡,動物死前的癥狀表現,現場周圍鼠藥使用情況(包括鼠藥的種類、投放時間和數量、儲存等),居民的生產、生活習慣(如飲水、飲食等)。
              對現場調查的資料作好記錄,進行現場拍照、錄音等。取證材料要有被調查人的簽字。
              2.3 現場中毒樣品的快速檢測
              中毒事件現場采集的可疑中毒食物、水、毒餌、鼠藥以及中毒病人的嘔吐物等樣品可在現場進行快速定性檢測。主要的香豆素類和茚滿二酮類抗凝血殺鼠劑的分類及穩定性見下表。測定毒餌、鼠藥中的其他香豆素類和茚滿二酮類抗凝血殺鼠劑,建議使用薄層色譜法進行定性測定(附件2和附件3)??紤]敵鼠鈉中毒時,可使用硫酸鐵試紙目視比色法定性測定(附件4)。
              2
              2.4 中毒事件的確認和鑒別
              2.4.1 中毒事件的確認標準
              同時具有以下三點,可確認為急性抗凝血類殺鼠劑中毒事件:
              a) 中毒病人有抗凝血類殺鼠劑接觸機會;
              b) 中毒病人出現以凝血功能障礙為主的臨床表現;
              c) 血液、嘔吐物和食物等樣品中檢出抗凝血類殺鼠劑。
              2.4.2 中毒事件的鑒別
              急性抗凝血類殺鼠劑群體性中毒事件通常容易確認,在數天內出現多名相互關聯的凝血功能障礙病人時應注意考慮此類事件的發生。
              2.5 現場醫療救援
              急性抗凝血類殺鼠劑中毒后有較長的潛伏期,通常不需要在現場進行特殊處理。如病人出現大量嘔血或咯血,應注意保持呼吸道通暢,建立靜脈通道,維持生命體征穩定。中毒病人應就近轉送至綜合醫院觀察和治療。
              3 中毒樣品的采集與檢測
              3.1 采集樣品的選擇
              可能導致中毒的食物、中毒病人的嘔吐物、胃內容物和血液是首選樣品。另外,可根據中毒事件的流行病學特點和衛生學調查結果,初步確定還應采集的其它樣品種類。
              3.2 樣品的采集方法
              嘔吐物、胃內容物、固體食品和半流質食品使用具塞玻璃瓶或聚乙烯瓶密閉盛放,采樣量50g~100g;液體樣品(血液除外) 使用具塞玻璃瓶或聚乙烯瓶盛放,采樣量300ml~500ml;血液樣品使用具塞的抗凝試管盛放,采血量應大于10ml。
              3.3 樣品的保存和運輸
              所有樣品采集后最好在4℃條件下冷藏保存和運輸,如無條件冷藏
              3
              保存運輸,樣品應在采集后24h內進行實驗室檢測。所有實驗室檢測完畢的樣品,應在冷凍條件下保存一周,以備實驗室復核。
              3.4 推薦的實驗室檢測方法
              3.4.1血液、尿液和動物組織中香豆素類和茚滿二酮類抗凝血類鼠藥的定性、定量測定—高效液相色譜–紫外法(附件5)。
              3.4.2血液、尿液和動物組織中香豆素類和茚滿二酮類抗凝血類鼠藥的定性、定量(確證)測定—高效液相色譜–串聯質譜法(附件6)。
              4醫院內的救治
              4.1 病人交接
              中毒病人送到醫院后,由接收醫院的接診醫護人員與轉送人員對中毒病人的相關信息進行交接,并簽字確認。
              4.2診斷和診斷分級
              救治醫生向中毒病人或陪護人員詢問病史,對中毒病人進行體格檢查和實驗室檢查,確認中毒病人的診斷,并進行診斷分級。
              診斷分級
              a) 觀察對象
              有抗凝血類殺鼠劑接觸機會,而無臨床癥狀者。
              b) 輕度中毒:
              出現鼻衄、牙齦出血、皮膚瘀斑及紫癜等癥狀。
              c) 中度中毒:在輕度中毒基礎上,具有下列之一者:
              i 血尿;
              ii便血;
              iii 陰道出血;
              iv 球結膜出血。
              d) 重度中毒:出現下列之一者:
              i消化道大出血;
              4
              5
              ii顱內出血;
              iii 咯血。
              4.3 治療
              接收醫院對所接收的中毒病人確認診斷和進行診斷分級后,根據病情的嚴重程度將病人送往不同科室進行進一步救治。觀察對象應進行至少1周醫學觀察,輕、中度中毒病人住院治療,重度中毒病人立即監護搶救治療,重點監測凝血功能指標變化。。
              4.3.1 清除體內毒物
              意識清晰者,早期可進行催吐。對經口中毒不足6h的病人應進行洗胃。
              4.3.2 特效解毒藥物
              維生素K1為抗凝血類殺鼠劑的特效解毒劑,需早期、足量應用。輕、中度中毒病人每次10mg~20mg,肌內注射或靜脈注射,每日2~4次;重度中毒病人每次20mg~40mg,靜脈注射,每日3~4次。在給予特效解毒劑期間,應密切監測中毒病人的凝血酶原時間。在凝血酶原時間恢復正常后,維生素K1逐漸減量,停藥后定期復查凝血酶原時間。
              4.3.3 其他止血措施
              重度中毒病人可予以新鮮血漿、凝血酶原復合物或凝血因子以迅速止血,并可早期、足量、短程給予腎上腺糖皮質激素。
              4.3.4 其他對癥支持治療
              加強營養、合理膳食,注意水、電解質及酸堿平衡,密切監護心、腦、肝、腎等重要臟器功能,及時給予相應的治療措施。
              5 應急反應的終止
              中毒食品和其他可疑毒物已經完全收繳和銷毀,中毒相關危險因素已被有效控制,未出現新的中毒病人且原有病人病情穩定24h以上。
              6
              附件1:
              抗凝血類殺鼠劑的理化性質和毒性
              毒性
              毒物名稱
              CAS
              分子式
              物理特性
              化學性質
              動物
              途徑
              LD50(mg/kg)
              備注
              溴敵隆
              28772-56-7
              C30H22O3Br
              白色或微黃色粉末,難溶于水,可溶于乙醇、丙酮等有機溶劑。
              化學性質比較穩定,但在高濕度時暴露在陽光下可分解。
              大鼠
              經口
              1.1
              有二次中毒的可能
              溴鼠靈
              56073-10-0
              C31H23O3Br
              白色或淡黃色粉末,不溶于水和石油醚,微溶于乙醇、苯、乙酸乙酯等,可溶于三氯甲烷。
              化學性質穩定
              大鼠
              經口
              0.26
              又名大隆、溴鼠隆,有二次中毒的可能
              氟鼠酮
              90035-08-8
              C33H25O4F3
              灰白色或白色粉末,不溶于水,溶于乙醇、丙酮、三氯甲烷等有機溶劑。
              化學性質穩定
              大鼠
              經口
              0.46
              又名殺它仗、氟鼠靈
              殺鼠靈
              81-81-2
              C19H16O4
              無色透明結晶或白色粉末,不溶于水和苯,可溶于乙醇、甲醇,易溶于丙酮。
              遇光可變色。
              雄大鼠
              經口
              323
              連續多次使用,毒性明顯增加。
              敵鼠
              82-66-6
              C23H16O3
              黃色粉末,微溶于水,可溶于丙酮、乙醇、苯等有機溶劑。
              化學性質穩定
              大鼠
              經口
              1.4~2.5
              殺鼠醚
              5836-29-3
              C19H16O3
              黃白色純晶或粉末,難不溶于水,可溶于乙醇和丙酮等有機溶劑。
              150℃以下穩定, 暴露在陽光下或紫外光下水溶液中分解。
              大鼠
              經口
              16.5
              又名立克命、殺鼠萘
              附件2
              薄層色譜法快速測定鼠藥、毒餌中的
              香豆素類抗凝血鼠藥
              1 適用范圍
              本法適用鼠藥、毒餌中香豆素類鼠藥的快速定性測定,測定結果可作為初步判斷事件性質的重要參考,可用其它分析方法進一步確定具體鼠藥品種和含量。
              2 原理
              含有香豆素類鼠藥類的毒餌和鼠藥樣品與標準品同時點樣在適合的薄層板上,使用展開劑展開達到分離,經紫外燈照射或顯色劑染色確定其Rf值,據被測物值與標準品Rf值的比較進行定性測定,或用薄層掃描儀對斑點進行原位掃描,則可進行定量測定。
              3 方法重要參數
              最低檢出范圍:2μg~5μg。
              4 儀器和設備
              4.1 試劑層析缸:電吹風;微量注射器;紫外燈。
              4.2 高效薄層板:硅膠GF254或高效薄層板。
              5 試劑和展開劑
              5.1 鼠藥標準品:純度99%。
              5.2 展開劑:
              5.2.1 苯-丙酮(9+1);
              5.2.2 二甲苯-丙酮(9+1);
              5.2.3 甲醇-醋酸-二氯乙烷(8+2+98);
              5.2.4 氯仿-甲醇(97+3);
              5.2.5 環已烷-丙酮-醋酸(7+2.5+0.5);
              5.2.6 二氯甲烷-甲醇-冰醋酸(90+8+2)。
              7
              6 操作方法
              6.1 樣品提?。悍Q2g粉碎過篩(40目)的毒餌樣品(根據樣品中鼠藥含量,確定樣品量),置于50ml離心管中。用10%鹽酸調節pH值至3~4,加lOml甲醇,在混懸器上提取5min,離心lOmin(300Orpm),將上清液移入25ml容量瓶中定容,待測。
              6.2 點樣:在薄層下端lcm基線上,用微量注射器點lOμl樣品制備液,然后根據樣品的濃度決定標準溶液的用量,一般為10μl。在同一塊板上同時點標準,空白和樣品。
              6.3 顯色:將點樣后的薄層板放入預先盛有展開劑并已達到飽和狀態的層析缸內。待溶劑展至約8cm以上時,取出吹干或自然揮干。在紫外燈下,觀看被測物的斑點呈現明顯的紫藍色熒光。展開劑為酸性時,斑點的熒光強度較弱,如于薄層板上噴10%的氫氧化鉀溶液或將薄層板置于氨水瓶口熏片刻,可提高熒光強度。定位也可采用化學顯色劑,如22%(W/V)三氯化銻氯仿溶液、8%(W/V)氫氧化鈉乙醇溶液、5%(W/V)硫酸乙醇溶液等。
              7 定性及定量方法
              根據樣品所呈現斑點的Rf值作定性測定。若在紫外燈下定位后,用薄層掃描儀對斑點進行原位掃描,則可進行定量測定。
              8
              附件3
              薄層色譜法快速測定毒餌中
              茚滿二酮類抗凝血鼠藥
              1 適用范圍
              本法適用于毒餌中茚滿二酮類鼠藥的快速定性測定,測定結果可作為初步判斷事件性質的重要參考,可用其它分析方法進一步確定具體鼠藥品種和含量。
              2 原理
              含有茚滿二酮類鼠藥類的毒餌和鼠藥樣品與標準品同時點樣在適合的薄層板上,經展開劑展開達到分離,經紫外燈照射或顯色劑顯色確定其Rf值,據被測物值與標準品Rf值的比較進行定性或定量測定,或用薄層掃描儀對斑點進行原位掃描,則可進行定量測定。
              3 方法重要參數
              最低檢出范圍:2μg~5μg。
              4 儀器和設備
              4.1 試劑層析缸:電吹風;微量注射器;紫外燈。
              4.2 高效薄層板.硅膠GF254或高效薄層板。
              5 試劑吸附劑。
              5.1 展開劑:
              甲醇-苯-甲酸(89+10+1);
              二氯乙烷-甲醇-氨水(79+20+1)。
              5.2 鼠藥標準:純度99% 。
              6 操作方法
              6.1 樣品提?。悍Q2g粉碎過篩(40目)的毒餌樣品(根據樣品中鼠藥含量,確定樣品量),置于50ml離心管中。用10%鹽酸調節pH值至5,加lOml甲醇,在高速混懸器上(1000Or/min)提取5min,離心lOmin,將上清
              9
              液移入25ml容量瓶中定容,待測。
              6.2 點樣:在薄層下端lcm基線上,用微量注射器點lOμl樣品制備液,然后根據樣品的濃度決定標準溶液的用量,一般為10μl。在同一塊板上同時點標準、空白和樣品。
              6.3 顯色:將點樣后的薄層板放入預先盛有展開劑并已達到飽和狀態的層板缸內。待溶劑展至約8cm以上時,取出吹干或自然揮干。在紫外燈下,觀看被測物呈黃色斑點。也可噴灑20%的三氯化鐵溶液或22%三氯化硒氯仿溶液進行顯色,前者陽性斑點成暗紅色,后者陽性斑點成粉紅色。甲酸能使茚滿二酮類鼠藥斑點顯紅色,用含甲酸的甲醇作展開劑時,可見紅色斑點隨展開劑上移,因此不必用其他顯色劑。
              7 定性及定量方法
              根據樣品所呈現斑點的Rf值作定性測定。若在紫外燈下定位后,用薄層掃描儀對斑點進行原位掃描,則可進行定量測定。
              10
              附件4
              敵鼠鈉鹽現場快速定性、半定量檢測方法
              (硫酸鐵試紙檢測方法)
              1 適用范圍
              本法適用食物(固體、半固體、液體)中毒患者嘔吐物、胃內容物中敵鼠鈉的快速測定,可作為初步判斷事件性質的重要參考,不能作為確定事件性質的依據。重大突發事件性質的判定,建議采用其他方法進行確證。
              2 原理
              敵鼠鈉鹽與硫酸鐵作用發生反應,生成磚紅色物質,呈色深淺與敵鼠鈉含量成正比,與標準色標比較進行定性、半定量測定。
              3 方法重要參數
              最低檢出量:0.045mg/ml。
              4 試劑
              4.1 5%硫酸鐵乙醇溶液。
              4.2 敵鼠鈉檢測試紙的制作:取定性濾紙,裁成適當大小,將濾紙浸泡于5%硫酸鐵乙醇溶液中,浸泡2h后取出,自然干燥。
              5 測定步驟
              5.1 標準色階的制作:配制0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L、4.0g/L、5.0g/L敵鼠鈉標準溶液,將檢測試紙插入標準溶液中,迅速取出,即得標準色階,如長期檢測可根據實物紙片電腦制作成色標。
              5.2 測定:取樣品5g(ml),加10ml丙酮浸漬5min,上清液備用。將敵鼠鈉檢測試紙插入上清液中,與標準色階比較定性、半定量測定。
              6 結果
              陽性反應:磚紅色。
              陰性反應:不變色。
              11
              附件5
              高效液相色譜–紫外法測定血液、尿液和動物組織中
              香豆素類和茚滿二酮類抗凝血類鼠藥
              1 適用范圍
              本方法適用于血液、尿液和動物組織樣品中殺鼠靈、殺鼠迷、溴敵隆、氟鼠靈、溴鼠靈、鼠得克、敵鼠、氯敵鼠、殺鼠酮和噻鼠酮殘留的定性、定量測定。重大突發事件性質的判定,建議采用其他方法進行確證。
              2 原理
              試樣經5%乙醇/乙酸乙酯提取和(或)固相萃取小柱富集和凈化后,在C18反相色譜柱上實現分離,采用紫外310nm波長檢測,根據色譜峰保留時間定性,標準曲線法峰面積定量。
              3 主要指標
              3.1定量檢出限
              尿液:(0.002~0.005)mg/L
              血液:(0.02~0.05)mg/L
              動物組織:(0.01~0.02)mg/kg
              3.2精密度
              在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。
              4 試劑與材料
              除另外說明外,水為GB/T 6682規定的一級水。
              4.1 甲醇:色譜純。
              4.2 乙酸乙酯:色譜純。 12
              4.3 乙酸:色譜純。
              4.4 乙腈:色譜純。
              4.5 Oasis®HLB小柱 (Waters)6ml,200mg或其它等效產品。
              4.6 鼠藥標準:殺鼠靈、殺鼠迷、溴敵隆、氟鼠靈與溴鼠靈(含量>95%)。
              4.7 鼠藥標準溶液
              4.7.1 鼠藥混合標準貯備液(1.0mg/ml)
              分別準確稱取10.0mg殺鼠靈、殺鼠迷、溴敵隆、氟鼠靈與溴鼠靈標準于10ml容量瓶中,用少量甲醇溶解后,并用甲醇定容至刻度。
              4.7.2 鼠藥混合標準溶液:
              分別準確吸取一定體積的殺鼠靈、殺鼠迷、溴敵隆、氟鼠靈與溴鼠靈的標準貯備液(1.0mg/ml)于10ml容量瓶中,用甲醇稀釋并定容至刻度。
              4.7.3乙酸/乙酸銨緩沖溶液(5mmol/L, pH=4)的配制
              稱取乙酸銨0.385g于100ml的燒杯中,用少量水溶解后,用純水稀至1L,并用1%乙酸調節pH值至4。
              5 儀器
              5.1高效液相色譜儀,配有紫外檢測器。
              5.2 分析天平:感量0.1mg和0.01g各一臺。
              5.3 旋渦混合儀。
              5.4 超聲波清洗器。
              5.5 全玻璃溶劑過濾器。
              5.6氮氣吹干儀。
              5.7勻質機。
              5.8 離心機。
              5.9固相萃取裝置。
              5.10 微量移液器(20μl、100μl和1000μl)。
              13
              6 測定步驟
              6.1 提取與凈化
              6.1.1 全血(血漿、血清)樣品的提取與凈化
              用微量移液器吸取全血(血漿、血清)1.0ml于5ml具塞聚丙烯離心管中,加入5%乙醇/乙酸乙酯1.0ml于旋渦混合儀上混合5min,以8000r/min離心5min,吸取上清液于另一離心管中,再用5%乙醇/乙酸乙酯1.0ml重復液-液萃取,合并有機相,用氮吹儀濃縮至干,加入甲醇/水(40:60,V/V)2.0ml于超聲波清洗器中超聲2min,再旋渦混合2min,然后全量轉入已活化過的Oasis® HLB小柱(預先以甲醇2.0ml和水2.0ml活化),相繼用20g/L乙酸/甲醇溶液(75:25, V/V)1.0ml和20g/L氨水/甲醇溶液(75:25, V/V)1.0 ml淋洗雜質,然后用體積分數為90%的甲醇水溶液2.0ml洗脫待測物,洗脫速度控制在0.5ml/min以下。收集洗脫液,在40℃水浴上用氮吹儀濃縮至干,殘渣用250μl甲醇溶解,渦旋混合,取樣10.0μl,注入高效液相色譜儀分析測定。
              6.1.2 尿液樣品的提取與凈化
              吸取尿液10.0ml于100ml燒杯中,以0.10mol/L鹽酸調節尿液pH值至4,使其慢速通過已活化的HLB小柱,余下操作同6.1.1。
              6.1.3 動物組織樣品的提取與凈化
              稱取搗碎勻漿的動物組織樣品2.0g于10ml聚丙烯離心管中,加入5%乙醇/乙酸乙酯5.0ml,然后用勻質機勻質2min,離心分離,上清液轉移至另一個10ml聚丙烯離心管后,重復用5%乙醇/乙酸乙酯5.0ml提取動物組織樣品1次,合并有機相,用氮吹儀揮干,加入純水5.0ml后于超聲波清洗器中超聲2min,然后用0.10mol/L鹽酸調節溶液pH值至4,全量轉入已活化的 HLB小柱,余下操作同
              6.2 混合基質標準工作溶液的制備
              14
              對于血液樣品,用微量移液器在5ml離心管中加入一定量的鼠藥混合標準溶液,用氮氣吹干后,加入健康人空白血樣1.0ml,旋渦混勻,配制成相當于濃度為0.02mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.50mg/L、1.0mg/L和5.0mg/L的各鼠藥血液加標樣品系列,余下操作同6.1.1。
              對于尿液樣品,用微量移液器在10ml容量瓶中加入一定量的鼠藥混合標準溶液,同時用健康人空白尿液稀至刻度,混勻,配制成相當于濃度為0.005mg/L、0.010mg/L、0.050mg/L、0.10mg/L、0.50mg/L和1.0mg/L的各鼠藥尿液加標樣品系列,余下操作同6.1.2。
              對于動物組織樣品,用微量移液器在10ml離心管中加入一定量的鼠藥混合標準溶液,用氮氣吹干后,加入已搗碎的動物組織空白樣品2.0g,混勻,配制成相當于濃度為0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.25mg/kg、1.0mg/kg、5.0mg/kg和10.0mg/kg的各鼠藥動物組織加標樣品系列,余下操作同6.1.3。
              混合基質標準工作溶液應現用現配。
              6.3 高效液相色譜-紫外法(HPLC-UV)分析
              6.3.1 色譜條件
              紫外檢測波長:310nm;
              其它同6.3.1。
              6.3.2 定量測定
              按照外標法進行定量計算。
              6.4 平行試驗
              按照以上步驟對同一試樣進行平行試驗測定。
              6.5 空白試驗
              除不稱取試樣外,均按照以上步驟進行。
              7 計算
              按外標法計算血液、尿液和動物組織中抗凝血類鼠藥的含量。
              15
              見下式: fVVCC××=11 fMVCC××=′11
              式中:
              C—血液和尿液中抗凝血類鼠藥的含量,mg/L;
              C’—動物組織中抗凝血類鼠藥的含量,mg/kg;
              C1—從標準曲線上求出的血液或尿液中抗凝血類鼠藥的含量,mg/L;
              V1—定容體積,ml;
              M—取樣質量,g;
              V—取樣體積,ml;
              f—試樣的稀釋倍數;
              計算結果表示到小數點后兩位。
              8. 紫外分離色譜圖
              抗凝血類鼠藥的混合基質標準工作溶液的典型UV色譜圖
              注:.1:殺鼠迷; 2:殺鼠酮; 3:殺鼠靈; 4:氯殺鼠靈; 5:敵鼠; 6:氯敵鼠; 7:鼠得克; 8:溴敵隆; 9:溴敵隆異構體; 10:氟鼠靈; 11:溴鼠靈; 12:噻鼠酮.
              16
              附錄6
              高效液相色譜–串聯質譜法測定血液、尿液和動物組織中
              香豆素類和茚滿二酮類抗凝血類鼠藥
              1適用范圍
              本方法適用于血液、尿液和動物組織樣品中殺鼠靈、殺鼠迷、溴敵隆、氟鼠靈、溴鼠靈、鼠得克、敵鼠、氯敵鼠、殺鼠酮和噻鼠酮殘留的定性、定量(確證)測定。
              2 原理
              試樣經5%乙醇/乙酸乙酯提取和(或)固相萃取小柱富集和凈化后,在C18反相色譜柱上實現分離,采用高效液相色譜-串聯質譜多反應監測(MRM)模式進行檢測。
              3 主要指標
              3.1定量檢出限
              尿液:(0.01~0.03)ng/ml
              血液:(0.1~0.3)ng/ml
              動物組織:(0.05~0.2)ng/g
              3.2精密度
              在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的20%。
              4 試劑與材料
              除另有說明外,水為GB/T 6682規定的一級水。
              4.1 甲醇:HPLC級。
              4.2 乙酸乙酯:HPLC級。
              4.3 乙酸:HPLC級。
              17
              4.4 乙腈:HPLC級。
              4.5 無水乙醇:HPLC級。
              4.6 Oasis® HLB小柱(Waters)6ml, 200mg或其它等效產品。
              4.7 鹽酸:優質純。
              4.8 乙酸銨:優質純。
              4.9 鼠藥標準物質:殺鼠靈、氯殺鼠靈、殺鼠迷、溴敵隆、氟鼠靈、溴鼠靈、鼠得克、敵鼠、氯敵鼠、殺鼠酮和噻鼠酮(純度>95%)。
              4.10鼠藥標準儲備溶液
              殺鼠靈、氯殺鼠靈、殺鼠迷、溴敵隆、氟鼠靈、溴鼠靈、鼠得克、敵鼠及、氯敵鼠、殺鼠酮和噻鼠酮標準儲備液(1.0mg/ml):分別稱取殺鼠靈、氯殺鼠靈、殺鼠迷、溴敵隆、氟鼠靈、溴鼠靈、鼠得克、敵鼠、氯敵鼠、殺鼠酮和噻鼠酮標準10.0mg于11個10ml容量瓶中,用少量甲醇溶解后,并用甲醇定容至刻度。標準儲備溶液避光4℃保存,可使用1個月。
              4.11 鼠藥混合標準溶液
              分別吸取一定體積的殺鼠靈、氯殺鼠靈、殺鼠迷、溴敵隆、氟鼠靈、溴鼠靈、鼠得克、敵鼠、氯敵鼠、殺鼠酮和噻鼠酮的標準儲備溶液(1.0mg/ml)于10ml容量瓶中,用甲醇稀釋并定容至刻度。
              4.12乙酸/乙酸銨緩沖溶液(5mmol/L, pH=4)的配制
              稱取乙酸銨0.385g于100ml的燒杯中,用少量水溶解后,用純水稀至1L,并用1%乙酸調節pH值至4。
              5 儀器
              5.1 實驗室常用設備。
              5.2 高效液相色譜/串聯質譜聯用儀,配有電噴霧離子化源(ESI)。
              5.3 分析天平:感量0.1mg和0.01g各一臺。
              5.4 旋渦混合儀。
              18
              5.5 超聲波清洗器。
              5.6 全玻璃溶劑過濾器。
              5.7氮吹儀。
              5.8 勻質機。
              5.9 離心機。
              5.10固相萃取裝置。
              5.11 微量移液器(20μl、100μl和1000μl)。
              6 測定
              6.1 提取與凈化
              6.1.1 全血(血漿、血清)樣品的提取與凈化
              用微量移液器吸取全血(血漿、血清)1.0ml于5ml具塞聚丙烯離心管中,加入5%乙醇/乙酸乙酯1.0ml于旋渦混合儀上混合5min,以8000r/min離心5min,吸取上清液于另一離心管中,再用5%乙醇/乙酸乙酯1.0ml重復液-液萃取,合并有機相,用氮吹儀濃縮至干,加入甲醇/水(40:60,V/V)2.0ml于超聲波清洗器中超聲2min,再旋渦混合2min,然后全量轉入已活化過的Oasis® HLB小柱(預先以甲醇2.0ml和水2.0ml活化),相繼用20g/L乙酸/甲醇溶液(75:25, V/V)1.0ml和20g/L氨水/甲醇溶液(75:25, V/V)1.0 ml淋洗雜質,然后用體積分數為90%的甲醇水溶液2.0ml洗脫待測物,洗脫速度控制在0.5ml/min以下。收集洗脫液,在40℃水浴上用氮吹儀濃縮至干,殘渣用250μl甲醇溶解,渦旋混合,取樣10.0μl,注入高效液相色譜儀分析測定。
              6.1.2 尿液樣品的提取與凈化
              吸取尿液10.0ml于100ml燒杯中,以0.10mol/L鹽酸調節尿液pH值至4,使其慢速通過已活化的HLB小柱,余下操作同6.1.1。
              6.1.3 動物組織樣品的提取與凈化
              19
              稱取搗碎勻漿的動物組織樣品2.0g于10ml聚丙烯離心管中,加入5%乙醇/乙酸乙酯5.0ml,然后用勻質機勻質2min,離心分離,上清液轉移至另一個10ml聚丙烯離心管后,重復用5%乙醇/乙酸乙酯5.0ml提取動物組織樣品1次,合并有機相,用氮吹儀揮干,加入純水5.0ml后于超聲波清洗器中超聲2min,然后用0.10mol/L鹽酸調節溶液pH 至4,全量轉入已活化的 HLB小柱,余下操作同6.1.1。
              6.2 混合基質標準工作溶液的制備
              對于血液樣品,用微量移液器在5ml離心管中加入一定量的鼠藥混合標準溶液,用氮氣吹干后,加入健康人空白血樣1.0ml,旋渦混勻,配制成相當于濃度為0.1ng/ml、0.5ng/ml、2.5ng/ml、10.0ng/ml、50.0ng/ml和100.0ng/ml的各鼠藥血液加標樣品系列,余下操作同6.1.1。
              對于尿液樣品,用微量移液器在10ml容量瓶中加入一定量的鼠藥混合標準溶液,同時用健康人空白尿液稀至刻度,混勻,配制成相當于濃度為0.01ng/ml、0.05ng/ml、0.25ng/ml、1.0ng/ml、5.0ng/ml和10.0ng/ml的各鼠藥尿液加標樣品系列,余下操作同6.1.2。
              對于動物組織樣品,用微量移液器在10ml離心管中加入一定量的鼠藥混合標準溶液,用氮吹儀吹干后,加入已搗碎的動物組織空白樣品2.0g,混勻,配制成相當于濃度為0.05ng/g、0.25ng/g、1.0ng/g、2.5ng/g、5.0ng/g和10.0ng/g的各鼠藥動物組織加標樣品系列,余下操作同6.1.3。
              混合基質標準工作溶液應現用現配。
              6.3 高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)分析
              6.3.1 色譜條件
              色譜柱:ZORBAX XDB C18柱(15 mm × 2.1mm i.d., 5μm)或相當者;
              20
              流動相:(A)甲醇,(B)乙酸/乙酸銨緩沖溶液(5mmol/L, pH=4),梯度洗脫:0→5min, 60%A; 5→10min, 60%A →80%A; 10→15min, 80%A;
              流速:0.4ml/min;
              柱溫:35℃;
              進樣體積:20.0μl。
              6.3.2 串聯質譜條件
              參見附錄A、B。
              6.3.3 定性測定
              按上述條件測定樣品和混合基質標準工作溶液時,如果樣品的色譜保留時間與混合基質標準工作溶液一致,定性離子對的相對豐度與濃度相當的混合基質標準工作溶液的相對豐度基本一致,則可判斷樣品中存在相應的被測物??鼓愂笏帢藴嗜芤旱囊患壻|譜圖和二級質譜圖參見附錄B,混合基質標準工作溶液的液相色譜-串聯質譜的MRM色譜圖參見附錄C。
              6.3.4 定量測定
              按照外標法進行定量計算。
              6.4 平行試驗
              按照以上步驟對同一試樣進行平行試驗測定。
              6.5 空白試驗
              除不稱取試樣外,均按照以上步驟進行。
              7 計算
              按外標法計算血液、尿液和動物組織中抗凝血類鼠藥的含量。
              見下式: fVVCC××=11 fMVCC××=′11
              21
              式中:
              C—血液和尿液中抗凝血類鼠藥的含量,ng/ml;
              C’—動物組織中抗凝血類鼠藥的含量,ng/g;
              C1—從標準曲線上求出的血液或尿液中抗凝血類鼠藥的含量,
              ng/ml;
              V1—定容體積,ml;
              M—取樣質量,g;
              V—取樣體積,ml;
              f—試樣的稀釋倍數;
              計算結果表示到小數點后兩位。
              22
              附錄A
              串聯質譜條件∗
              離子源:大氣壓電噴霧離子源;
              掃描方式:負離子掃描;
              掃描范圍(m/z):50~600;
              毛細管電壓:2700V;
              毛細管出口電壓:-205V;
              干燥溫度:350℃;
              干燥氣流速:9.0L/min;
              噴霧器壓力:35.0psi;
              檢測模式:多反應監測(MRM),監測條件見表A.1。
              表A.1、待測物的多反應監測(MRM)條件
              化合物
              母離子 (m/z)
              定量離子(m/z)
              確證離子 (m/z)
              峰寬 (m/z)
              源內碰撞解離電壓(V)
              殺鼠靈
              307
              161
              250,117
              2.0
              0.95
              氯殺鼠靈
              341
              161
              284,117
              2.0
              1.00
              殺鼠迷
              291
              247
              219, 187
              2.0
              0.90
              溴敵隆
              527
              465
              491, 389
              2.0
              1.50
              氟鼠靈
              541
              382
              289, 161
              2.0
              1.50
              溴鼠靈
              523
              477
              373, 219
              2.0
              1.50
              鼠得克
              443
              293
              161,143
              2.0
              1.10
              敵鼠
              339
              167
              145,172
              2.0
              1.25
              氯敵鼠
              373
              201
              145,172
              2.0
              1.05
              殺鼠酮
              229
              172
              145,214
              2.0
              0.90
              噻鼠酮
              537
              151
              203,371
              2.0
              0.95
              ∗ 所列參數是在Agilent 1100 series LC/MSD Trap SL型質譜儀上完成的,此處列出試驗用儀器型號僅是為了提供參考,并不涉及商業目的,鼓勵標準使用者嘗試采用不同廠家或型號的儀器。 23
              附錄B
              抗凝血類鼠藥的一級質譜和二級質譜圖 24
              a–殺鼠靈;b–氯殺鼠靈;c–殺鼠迷;d–溴敵隆,e–氟鼠靈;f–溴鼠靈;g–鼠得克;h–敵鼠,i–氯敵鼠;j–殺鼠酮;k–噻鼠酮
              圖B1、抗凝血類鼠藥的標準溶液一級質譜圖.
              25
              26
              a–殺鼠靈;b–氯殺鼠靈;c–殺鼠迷;d–溴敵隆,e–氟鼠靈;f–溴鼠靈;g–鼠得克;h–敵鼠,i–氯敵鼠;j–殺鼠酮;k–噻鼠酮
              圖B 2、抗凝血類鼠藥的標準溶液二級質譜圖
              27
              附錄C
              抗凝血類鼠藥的混合基質標準工作溶液的MRM色譜圖
              28
              a–殺鼠靈;b–氯殺鼠靈;c–殺鼠迷;d–溴敵隆,e–氟鼠靈;f–溴鼠靈;g–鼠得克;h–敵鼠,i–氯敵鼠;j–殺鼠酮;k–噻鼠酮
              注:在選定條件下, 殺鼠迷、殺鼠酮、殺鼠靈、氯殺鼠靈、敵鼠、氯敵鼠、鼠得克、溴敵隆、溴敵隆異構體、氟鼠靈、溴鼠靈和噻鼠酮的保留時間分別為2.78, 4.15, 4.42, 6.11, 7.72, 9.08, 10.45, 11.42, 12.11, 13.08, 14.05和14.86min.
              圖C. 抗凝血類鼠藥的混合基質標準工作溶液的MRM色譜圖
              29
              附錄C
              抗凝血類鼠藥的混合基質標準工作溶液的MRM色譜圖
              30
              a–殺鼠靈;b–氯殺鼠靈;c–殺鼠迷;d–溴敵隆,e–氟鼠靈;f–溴鼠靈;g–鼠得克;h–敵鼠,i–氯敵鼠;j–殺鼠酮;k–噻鼠酮
              注:在選定條件下, 殺鼠迷、殺鼠酮、殺鼠靈、氯殺鼠靈、敵鼠、氯敵鼠、鼠得克、溴敵隆、溴敵隆異構體、氟鼠靈、溴鼠靈和噻鼠酮的保留時間分別為2.78, 4.15, 4.42, 6.11, 7.72, 9.08, 10.45, 11.42, 12.11, 13.08, 14.05和14.86min.
              圖C. 抗凝血類鼠藥的混合基質標準工作溶液的MRM色譜圖

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